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            【外泌體純化】新型親和法外泌體提取試劑盒 ——MagCapture 外泌體提取試劑盒PS

            來源:作者:人氣:-發表時間:2019-11-07 10:31:00【
            內毒素檢測耗材
            MagCapture™外泌體提取試劑盒 PS采用磷酯酰絲氨酸(PS)親和Tim4蛋白固化磁珠(PS親和法)的方法可以簡便快捷地提取高純度的完整外泌體和其他細胞外囊泡(EVs)。如果想要得到更高純度的外泌體,請使用10,000×g離心后的上清。西寶生物作為Wako指定國內經銷商可提供外泌體研究整體解決方案,咨詢請撥打400-021-8158
            該試劑盒使用含有EDTA的中性洗脫緩沖液將外泌體完整洗脫下來,所提取的完整外泌體和其他EVs可用于不同實驗,包括電鏡分析(TEM)、納米粒子追蹤(NTA)分析、投喂實驗、分子組成(蛋白質、脂質、核酸等)分析等。
            膜表面磷酯酰絲氨酸(PS)親和法
            免疫系統中外泌體的組成分子
            Tim4蛋白固化磁珠,在金屬離子存在的條件下親和細胞外囊泡表面的磷酯酰絲氨酸(PS),然后使用含有EDTA的洗脫液進行洗脫,捕獲高純度的完整細胞外囊泡
            優點 & 特色
            使用新型親和提取方法
              ● 通過PS親和分子回收
              ● 低背景值
              ● 在中性條件下通過螯合試劑進行溫和洗脫
              ※ 可獲得高純度,完整的外泌體
            無需進行超離
              ● 使用磁珠改進了操作
              ● 流程優化
              ※ 高重復性
            與其他提取方法相比
            方法
            外囊泡純度
            囊泡狀態
            可操作性
            回收量
            PS親和法
            ■■■
            完整
            簡便穩定
            ■■■
            超速離心法
            ■■
            完整
            簡便
            ■■
            聚合物沉淀法
            完整
            簡便快捷
            ■■■■
            密度梯度離心法
            ■■■■
            完整
            復雜
            ■■
            抗體親和法
            ■■■
            不完整
            簡便穩定
            ■■
            樣品類型:細胞培養上清、血清、血漿、尿液等。
              ● 可以純化高純度和完整的細胞外囊泡
              ● 可以從細胞上清液、血清、血漿和尿液中純化外囊泡
              ● 重復性高,回收量穩定
              ● 簡易操作(約3.5小時)
              ● 啟用多個樣品(無需超速離心)
            產品列表
            產品名稱
            包裝規格
            保存條件
            MagCapture™Exosome Isolation Kit PS
            10次
            (產品編號:293-77601)
            2次
            (產品編號:299-77603)
            2-10°C
            試劑盒成分
            (1)鏈霉親和素磁珠
            (2)生物素標記的外泌體捕獲
            (3)外泌體捕獲免疫固定緩沖液
            (4)外泌體結合增強劑(×500)
            (5)洗滌緩沖液
            (6)外泌體洗脫緩沖液
            (7)反應管
            <10 次>
             600 μL×1 管
             100 μL×1 管
             35 mL×1 瓶
             500 μL×1 管
             75 mL×2 瓶
             5 mL×1 瓶
             22 管
            <2 次>
             120 μL×1 管
             20 μL×1 管
             7 mL×1 瓶
             100 μL×1 管
             1 mL×1 瓶
             1 管
            *每套試劑盒能完成5次回收實驗,即實際使用量為10×5次/Kit與2×5次/Kit
            案列*應用  
            從血清、血漿、尿液中提取的細胞外囊泡的分析
            從人血清中提取外泌體的產量比較
            使用該試劑盒,超離法和抗體親和法提取人血清的外泌體,接著用CD9和CD63抗體進行免疫印跡實驗。
            ● 檢測抗體
            抗CD9兔多抗,System Bioscience公司
            抗CD63兔多抗,System Bioscience公司
            ● 免疫印跡(WB)數據
            從人EDTA血漿中提取外泌體
            分別從1mL的EDTA血漿、EDTA血漿(超濾更換緩沖液)、人血清中提取外泌體,進行WB檢測(抗Flotillin2抗體)。
            ● 檢測抗體
            抗Flotillin-2小鼠單抗(29/Fotillin-2),BD Bioscience公司
            ● 使用樣品量
            各1mL
            各樣品結果分別對應150μL樣品量。從100μL提取物中取出15μL,添加5μL的4×SDS樣品緩沖液,全部上樣。
            從人尿液中提取外泌體的回收量比較
            1mL人尿液分別通過本試劑盒、聚合物沉淀法、超離法進行外泌體回收,并做免疫印跡(WB)檢測(抗CD9抗體)。
            ● 檢測抗體
            抗CD9兔多抗,System Biosciences公司
            ● 使用樣品量
            各1mL
            ● 免疫印跡(WB)數據
            各樣品結果分別對應150 μL尿液樣品。從100 μL提取物中取出15 μL,加入5 μL的 4×SDS樣品緩沖液,全部上樣。
            與傳統沉淀法的功能比較實驗:
            分別用本試劑盒、超離心法和聚合物沉淀法從K562(人慢性骨髓性白血病)細胞培養上清(無血清培養上清或10%Exosome-depleted FBS添加培養基)提取外泌體,分別比較三種方法的外泌體回收量和外泌體純度。
            MagCapture™ 外泌體提取試劑盒PS【PS親和法】
            按照試劑盒的操作說明(反應時間:3小時),從1 mL經過離心處理(10,000×g,30min)的K562細胞培養上清(無血清培養基或10% Exosome-depleted FBS添加培養基※1)中提取外泌體。
            超速離心法
            將10 mL經過離心處理(10,000×g,30 min)的K562細胞培養上清(無血清培養基或10% Exosome-depleted FBS添加培養基※1)進行超離(110,000×g,70 min),用TBS緩沖液重懸沉淀物后,再進行超離(110,000×g,70 min),回收沉淀部分。
            聚合物沉淀法
            從1mL經過離心處理(10,000×g,30 min)的K562細胞培養上清(無血清培養基或10% Exosome-depleted FBS添加培養基※1)中,按照市售的A公司產品的操作說明(靜置時間:過夜)提取外泌體。
            ※1:110,000×g離心2小時,在不吸到沉淀的前提下回收上清。
            比較提取的外泌體的透射電子顯微鏡(TEM)分析結果和納米粒子追蹤(NTA)分析結果
            分別用本試劑盒、超離法、聚合物沉淀法提取外泌體,用NanoSight LM10檢測外泌體片段的粒子直徑。另外,用最終濃度為2%的多聚甲醛固定提取到的外泌體片段(2~4×1010 particles),在透射電子顯微鏡進行分析。 
            電子顯微鏡圖像 數據提供:金澤大學 醫學系 華山教授、大阪大學 iFReC 中井先生
            MagCapture™ 可提取到很多100 nm左右的粒子,在透射電子顯微鏡中也可以確認到很多細胞外囊泡。
            K562細胞培養上清提取的外泌體回收量和純度的比較(無血清培養基)
            用PS親和法、超離法和聚合物沉淀法從K562 細胞培養上清(無血清培養基)獲得樣品進行電泳。接著用銀染色和WB法(CD63, Flotilin-2和Lamp-1抗體)進行實驗。
            *回收量,不是回收率
            ● 檢測抗體
              抗CD63小鼠單抗(MEM-259)
              抗Flotillin-2 小鼠單抗(29/Flotillin-2),BD Bioscience公司
              抗Lamp-1小鼠單抗(25/Lamp-1),BD Bioscience公司
            K562細胞培養上清提取外泌體的回收量和純度的比較(10%FBS-添加培養基)
            用MagCapture™ 外泌體提取試劑盒、超離法和聚合物沉淀法,從K562 細胞培養上清(10% 去外泌體 FBS補充培養基)獲得樣品進行電泳,用銀染法和WB法(CD63、Lamp-1和Flotilin-2抗體)進行實驗。同時,對外泌體提取片段進行質譜測定,比較所有測定的多肽中來自K562細胞的人來源多肽的比例(由于添加到細胞培養基的FBS中牛蛋白聚集體是混雜的,所以人來源多肽的比率會下降)。
            ● 檢測抗體
              抗CD63小鼠單抗(MEM-259)
              抗Flotillin-2小鼠單抗 (29/Flotillin-2),BD Bioscience公司
              抗Lamp-1小鼠單抗(25/Lamp-1),BD Bioscience公司
              健康人血清來源的外泌體中提取miRNA和mRNA的回收量比較
            實驗數據
            ①運用不同方法提取外泌體并比較從中提取的microRNA和mRNA的回收量
            通過超離法和PS親和法將EVs從正常人血清中分離,然后使用microRNA提取試劑盒(產品編號295-71701)提取RNA。通過qRT-PCR分析提取的RNA,并比較microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。
            相比超離法,PS親和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高產量。
            ②運用不同的RNA提取方法提取microRNA和mRNA的回收量比較
            運用PS親和法將EVs從正常人血清中分離,然后使用microRNA提取試劑盒(產品編號295-71701)或基于AGPC法的試劑提取RNA。通過qRT-PCR分析提取的RNA,并比較microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。
            對比AGPC法,使用microRNA提取試劑盒更能有效提取PS親和法純化所得EVs中的microRNA和mRNA
            外泌體蛋白質組學分析
            <實驗內容及結果>
            分別利用PS親和法、超離法、聚合物沉淀法,從含10% FBS(不含外泌體)的K562細胞培養上清液中提取外泌體。將提取樣品用10%聚丙烯酰胺電泳分離,剪切出全部的蛋白質條帶。然后在凝膠內進行消化,用LC-MS對蛋白質進行檢測。對上述三種方法提取的外泌體進行蛋白質組合的相關性比較。
            比較通過MASS分析鑒定的前10個蛋白質
            白色柱:源自外囊泡的人類蛋白質
            灰色柱:來自FBS的牛蛋白污染物
            紅 色:來自外囊泡的標記蛋白
            樣品:K562細胞培養基(含有10%去除外泌體胎牛血清)
             
            PS親和法
            超離法
            聚合物沉淀法
            1
            71 kDa熱休克同源蛋白
            (Heat shock cognate 71kDa protein)
            DNA依賴蛋白激酶催化亞基基因
            (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)
            補體C3
            (Complement C3)
            2
            膜聯蛋白A6
            (Annexin A6)
            鐵轉蛋白受體1
            (Transferrin receptor protein1)
            α2-巨球蛋
            (Alpha-2-macroglobulin)
            3
            鐵轉蛋白受體1
            (Transferrin receptor protein1)
            血清白蛋白
            (Serum albumin)
            纖連蛋白
            (Fibronectin)
            4
            V-ATP酶A亞基
            (V-type proton ATpase catalytic subunit A)
            ATP依賴RNA解旋酶
            (ATP-dependent RNA helicase A)
            血清白蛋白
            (Serum albumin)
            5
            浮艦蛋白-2
            (Flotillin-2)
            微管蛋白β5
            (Tubulin beta-5 chain)
            血小板反應蛋白-1
            (Thrombospondin-1)
            6
            程序性細胞死亡6互作蛋白(Programmed cell death 6-interacting protein)
            71 kDa熱休克同源蛋白
            (Heat shock cognate 71 kDa protein)
            補體C4
            (Complement C4)
            7
            細胞表面抗原4F2重鏈
            (4F2 cell-surface antigen heavy chain )
            脂肪酸合成酶
            (Fatty acid synthase)
            α-1抗蛋白酶
            (Alpha-1-antiproteinase)
            8
            膜聯蛋白A1
            (Annexin A1)
            細胞表面抗原4F2重鏈
            (4F2 cell-surface antigen heavy chain)
            載脂蛋白-β-100
            (Apolipoprotein-β-100)
            9
            220kDa激酶D相互作用底物
            (Kinase D-interacting substrate of 220kDa)
            U5小核核糖核蛋白的解旋酶
            (U5 small nuclear ribonucleoprotein helicase)
            胎兒血紅蛋白亞單位
            (Hemoglobin fetal subunit beta)
            10
            膜聯蛋白A2
            (Annexin A2)
            β4微管蛋白
            (Tubulin beta-4B chain)
            β5微管蛋白
            (Tubulin beta-5 chain)
            成對組合相關性比較
            應用數據
            Protein Assay BCA Kit檢測外泌體的蛋白質濃度
            Protein Assay BCA Kit是利用二辛可寧酸(BCA)定量檢測溶液中的蛋白質濃度的試劑盒,是蛋白質定量檢測法中最通用的方法。其原理為,堿性條件下的蛋白質Cu2+離子被還原為Cu+。Cu+與BCA形成絡合物,即產生紫色螯合物,蛋白質濃度與紫色螯合物顏色深淺有關,通過測定562 nm處的吸光度,并與標準曲線做比照,即可定量溶液中的蛋白質濃度。
            利用MagCapture™外泌體提取試劑盒從細胞培養上清液中提取外泌體,通過Protein Assay BCA Kit高靈敏的檢測外泌體中蛋白質濃度。
            【實驗內容及結果】
            將通過MagCapture™ 外泌體提取試劑盒提取的25 μL外泌體溶液分注于96孔板中,加入 Protein Assay BCA Kit中試劑A和試劑B混合液200 μL。之后60℃孵育30分鐘,檢測560 nm吸光度(圖1)。結果表明,通過Protein Assay BCA Kit的高靈敏度檢測,可測定提取后外泌體中蛋白質濃度。

            圖1. Protein Assay BCA Kit 檢測BSA的檢量線和提取的外泌體蛋白質濃度的檢測
            由于外泌體蛋白質濃度相當低,因此BCA測定時不要稀釋樣品。
            ① 將BSA標準溶液按照250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL和空白對照,分別每孔25 μL加到96孔板中。
            ② 分別把提取的外泌體和洗脫緩沖液(空白)按照每孔25 μL加入96孔板。
            ③ 把200μL Protein Assay BCA Kit(產品編號:297-73101)的試劑A盒試劑B混合液(A:B=50:1)加入放有樣品的孔板中。
            ④ 60℃孵育30分鐘
            ⑤ 室溫條件下降低孔板溫度
            ⑥ 測定560 nm的吸光度
            產品編號
            產品名稱
            包裝
            訂購熱線:400-021-8158
            297-73101
            Protein Assay BCA Kit
            蛋白測定試劑盒(二喹啉甲酸)
            250次用
            015-25613
            2mg/mL Albumin Solution from Bovine Serum
            2mg/mL 牛血清蛋白溶液
            1 mL×10
            外泌體的標記和Hela細胞導入實驗
            【實驗概要】
            用PKH67(Sigma公司)標記MagCapture™ 外泌體提取試劑盒提取的細胞外囊泡,Hela細胞導入確認
            <外泌體PKH67標記>
            1. MagCapture™ 外泌體提取試劑盒提取外泌體(實驗當天從K562細胞培養上清液提取外泌體)
            2. 用BCA Assay和NanoSight檢測樣品的蛋白質濃度和粒子濃度
            3. 將相當于5 μg*蛋白量的外泌體樣品溶液分裝至1.5 mL管中。
            *請配制合適的使用量
            4. 將2.0 μL的PKH linker溶解在0.25 mL的DiluentC中。…4×Dye solution*
            *請配制合適的使用量
            5. 添加1/3樣品量的4×Dye solution至樣品中,混合后在室溫中孵育5-10分鐘。
            6. 根據附帶的操作說明用PBS平衡Exosome Spin Columns (MW 3000)(Thermo公司)。
            7. 將100 μL樣品分別加入上述平衡后的旋轉柱*中,離心(最大添加量:100 μL)。
            *準備必需的支數。
            8. 將外泌體溶液*加入到已經接種好Hela細胞的培養皿中,24小時后用顯微鏡觀察并利用流式細胞儀進行分析。
            *根據實驗調節外泌體添加量

            圖1. PKH標記外泌體的細胞捕獲觀察
            從16 mL K562培養上清液中超濾濃縮得到4 mL培養上清液作為樣品,通過PS親和法提取外泌體。
            ● 提取的外泌體蛋白質濃度:22.3 ng/μL
            ● 粒子濃度:1.2×108 particles/mL
            將上述標記的外泌體溶液全部加入接種好的Hela細胞中,24小時后用熒光顯微鏡(左)和流式細胞儀(右)檢測捕獲情況。
            Opti-MEM:取相同量用PKH標記后添加到細胞中作為陰性對照。
            細胞培養上清•血清•血漿的預處理操作
            樣品預處理:對樣品進行1,200×g離心操作※1。如果要得到更高純度的外泌體,則按照下述步驟對樣品進行10,000×g離心操作※2。
            下文是細胞培養上清、血清/血漿的預處理方法。其他體液樣品的預處理操作,請參考血清/血漿的實驗步驟,做適當調整。
            更換緩沖液(限制過濾)操作
            用50 mL TBS 緩沖液對1 mL 已經經過離心處理的EDTA 血漿樣品進行緩沖液更換。
            1. 把19 mL TBS 加進VivaSpin20(100K)中。
            2. 把1 mL 離心過的EDTA 血漿上清添加在第1. 的VivaSpin20(100K)中,混勻。
            3. 把第2. 的VivaSpin20(100K)在4℃下進行離心處理。
            4. 減少上線的液體后,在VivaSpin20(100K)中追加10 mL TBS 緩沖液。
            5. 4℃下離心處理。
            6. 減少上面的液體后,在VivaSpin20(100K)中追加10 mL TBS 緩沖液。
            7. 4℃下離心處理。
            8. 減少上面的液體后,在VivaSpin20(100K)中追加11 mL TBS 緩沖液。
            9. 4℃下離心處理直至樣品液量達到1 mL 以下。
            10. 進行提取。
            MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 操作步驟
            MagCapture™ 外泌體產品
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            MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS
            Exosome外泌體提取試劑盒PS
            10次用
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            Exosome外泌體提取試劑盒PS
            2次用
            016-27061
            Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)
            抗CD63單抗(3-13)
            20ul
            012-27063
            Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)
            抗CD63單抗(3-13)
            100ul
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            Magnet Stand
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            PS Capture™ Exosome Flow Cytometry Kit
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